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细胞培养中支原体污染的危害与一般检测方法
2023.04.20   点击1004次

支原体(mycoplasma),又称霉形体,为目前发现的最小的最简单的原核生物。支原体细胞中唯一可见的细胞器是核糖体(支原体是原核细胞,原核细胞的细胞器只有核糖体)。培养细胞中支原体污染的来源包括所使用的动物来源的一些产品如血清、工作人员或已被支原体污染的细胞株系。

支原体污染的严重性:

1、细胞外形可以没有明显的变化,支原体可以与细胞共存,污染后细胞液不会死亡,培养基一般不发生浑浊;

2、使用被支原体污染的细胞做实验会严重影响实验的结果,因为支原体会抑制细胞生长;导致染色体畸变;细胞膜抗原性改变;细胞复苏后存活率降低等。

3、影响细胞的代谢和功能:培液中的精氨酸被支原体大量消耗,引起细胞蛋白质、DNA、rRNA、mRNA的合成障碍;支原体活动使培液成分发生改变(如发酵型支原体降解糖类产生酸性物质),影响细胞代谢。

4、培养过程中细胞破碎较多,培养基pH变化明显,需要频繁更换新鲜培养基;

5、细胞被支原体污染后会形成共生体系导致污染不断扩大。

为确定有无支原体污染,一般使用以下检测方法:

1、相差显微境检测

将细胞按种于事先放置于培养瓶内的盖玻片上,24h后取出,用相差油镜观察.支原体呈暗色微小颗粒位于细胞表面和细胞之间。

2、分离培养法

支原体的病原学检测主要是从被污染的细胞、鸡胚中分离培养出支原体来确定,分离培养法是检测支原体污染中最为可靠准确的方法。但是支原体对环境的影响敏感,容易被灭活,而且分离培养操作相对繁琐,所需时间较长,因此只能够对支原体污染进行定性观察。分离培养法在常规的支原体检测中多用于辅助其它检测方法。

3、DNA荧光染色法

DNA荧光染色法较分离培养法缩短了检测周期,主要用于细胞培养中污染支原体的检测。DNA荧光染色法正是利用荧光染色剂双苯咪唑(Bisbenzimidzole)Hoechst 33258能够结合支原体DNA中的A-T碱基富集区域的原理,被支原体污染的细胞经染色后,其细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一的荧光点,即是富含A-T碱基区域的支原体DNA。

4、PCR方法

PCR作为一种快速、灵敏、特异且简便的基因诊断技术已应用于科学研究和疾病的诊断。根据支原体基因组内的保守序列设计特异引物,对待检样品的核酸进行扩增,通过对扩增产物的大小分析作出诊断。PCR检测技术用于支原体污染的检测,周期短、灵敏度高、特异性好、操作简单且一次可检测大量样品。

5、酶联免疫吸附试验(ELISA)

ELISA用于支原体污染的检测中,有着良好的特异性和敏感性,一次可以完成大量样品的检测。如今已有LONZA等公司开发了针对细胞中污染支原体的检测试剂盒,具有简便、快速与定量定性检测等特点。

6、电镜

一般在细胞培养48~72小时,细胞接近汇合前,用胰酶消化细胞制成细胞悬液后进行固定、包埋、切片后才能进行观察。

7、定期检测

支原体感染会使培养细胞慢慢枯萎,因此对培养细胞定期进行支原体检测非常重要。一般来说每1至3个月就应该进行一次支原体检测。将定期支原体检测常规化坚持下去,是细胞培养实验室应对支原体感染的关键。

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